Ingineria țesuturilor pentru reconstrucția epiteliului cornean
Ursula Schlötzer-Schrehardt , … Friedrich E. Kruse , în bolile oculare de suprafață: Cornea, Conjunctiva și Tear Film , 2013
Keratin Films
Keratinele sunt un grup de proteine structurale bogate în cisteină formate în celulele epiteliale ale vertebratelor. Keratina obținută din păr sau lână a fost propusă ca material adecvat pentru producerea de filme sau schele pentru cultivarea celulelor și ingineria tisulară. 84Transparent cheratina filme au fost proiectate printr – un procedeu în mai multe etape, inclusiv keratina extracție, dializa neutru și alcalin, uscare și un proces de întărire, și au fost compuse dintr – un nanoparticulate keratina structură. Caracteristicile filmului pot fi modificate prin modificarea compoziției proteice, adăugarea agenților de înmuiere sau prin modificarea temperaturii și duratei de întărire. Filme bazate pe keratina de păr umanăa prezentat o rezistență biomecanică îmbunătățită și o transmisie a luminii în comparație cu HAM, dar a oferit condiții comparabile pentru adeziunea și proliferarea celulelor epiteliului cornean. Sa sugerat că filmele de keratină pot reprezenta o alternativă nouă, promițătoare pentru reconstrucția suprafeței oculare, dar trebuie să se realizeze investigații suplimentare.
21.2.1.7 Keratin
Keratina face parte din familia mare de proteine structurale care face stratul exterior al pielii umane, componenta părului și unghiile. Aceste țesuturi nemineralizate dure și insolubile, aranjate sub formă de mănunchiuri de filamente intermediare, fac tesuturile de protecție ale vertebratelor. Ele se găsesc în stratul cornificat al epidermei și proprietățile lor se bazează pe agregarea lor supermoleculară. Aplicarea biomaterialului de keratină a fost inițiată cu decenii în urmă prin utilizarea părului și a unghiei ca sursă de producție. Mai devreme, în 1910, Heinemann a introdus aplicarea de keratină în vindecarea rănilor și livrarea de medicamente [ 91 ]. Acum trei decenii, aplicațiile mai detaliate ale keratinei au fost raportate în aplicațiile cardiovasculare [92 ]. Mai târziu, cercetările pe bază de keratină s- au mutat la vindecarea rănilor, livrarea de medicamente și alte domenii legate de ingineria țesuturilor [ 93 , 94 ]. Bazelebiomateriale bazate pe keratine conțin potențialele site-uri de recunoaștere celulară, care pot imita potențial ECM. Un studiu recent confirmă prezența unor situsuri similare de recunoaștere pe suprafața keratinei , făcând biomaterialele de cheratină excelente pentru adeziunea și proliferarea celulelor [ 95 , 96 ].
7.4.4.3 Agent hemostatic
Hidrogelurile de keratină din părul uman au fost raportate că acționează ca agent hemostatic într-un model de iepure de leziuni hepatice [ 98 ]. În comparație cu alte hemostate utilizate frecvent (balsamuri QuickClot și HemCon), gelul hemostatic keratină aîmbunătățit supraviețuirea la 24 h și a efectuat, dacă nu și mai bine, hemostazele convenționale în ceea ce privește pierderea totală de sânge și indicele de șoc. Keratina Gelul utilizat în aceste experimente au acționat pe locul leziunii instigând formarea trombusului și prin formarea unei etanșări fizică a plăgii , care a acționat ca un schelet poros pentru a permite infiltrarea celulară și formarea de țesut granulate [ 98 ].
O mascare a epitopilor
Keratinele sunt prezente în MB într-o organizație structurală diferită decât în IF. Prin urmare, anumiți anticorpi care recunoaște epitopii dependenți de conformație pe keratină prezintă diferite proprietăți de legare la MB și IF ( Hazan și colab ., 1986 ). Am constatat că mai mulți anticorpi specifici pentru K8 au reacționat de preferință cu MB (observație nepublicată). Mai mult, MB-urile acționează ca parteneri de înaltă afinitate și promiscuu pentru diferitele polipeptide de keratină și le stabilizează. In anumite boli hepatice, când hepatocite exprimă aberant tip de canal biliar keratins , MBs sunt de asemenea pozitive pentru K19 sau K7 ( Dinges și colab , 1992;. VanEyken și colab., 1988).
Cheratină
Keratin este numele unei familii de proteine structurale care sunt abundente în stratul exterior al pielii umane, în păr și în unghii. Keratina este bogata in cisteina de aminoacizi si are capacitatea de a se auto-asambleaza in fascicule de fibre. În cadrul acestor fascicule de fibre, firele individuale sunt în continuare reticulate prin legături SS (sulf-sulf) care implică catenele laterale cisteină. În acest fel, keratinaformează structuri deosebit de dure, insolubile, care se numără printre cele mai puternice țesuturi neminerizate găsite în natură. Singurul alt țesut nemineralizat care seamănă cu duritatea keratineieste chitina (materialul găsit în exoscheletul insectelor și în cochilia exterioară a crustaceelor).
Deoarece părul uman este bogat în keratină , această proteină este adăugată la multe produse de îngrijire a părului. Cu toate acestea, ca și în cazul reclamațiilor înșelătoare de marketing efectuate pentru produsele de piele anti-îmbătrânire care conțin elastină, nu există dovezi că ceara aplicată extern poate pătrunde în structura părului. In timp ce keratina a fost in mare parte studiata pentru utilizarea in produsele cosmetice (ingrijirea parului), explorarea proprietatilor de keratina a condus, de asemenea, la dezvoltarea de biomateriale pe baza de keratina pentru utilizare in aplicatii biomedicale. Proprietățile mecanice neobișnuite și rezistența keratinei și capacitatea sa de auto-asamblare au fost forța motrice a acestor studii biomedicale.
Istoria cercetării de keratină ilustrează o altă provocare majoră atunci când se utilizează polimeri derivați biologic ca biomateriali. Pe baza sursei de animale utilizate și în funcție de procedura de extracție exactă utilizată, preparatele individuale de keratină pot diferi semnificativ una de cealaltă. Variabilitatea și ireproductibilitatea preparatelor individuale este o caracteristică generală a majorității polimerilor derivați biologic. Cercetările timpurii, în cea mai mare parte a laboratorului Yamauchi, s-au axat pe prepararea filmelor proteice din keratina extrasă din lână și din părul uman. Aceste filme pure de proteine erau fragile și slabe. Cercetatorii nu au putut reproduce in laborator rezistenta deosebita a keratinei formate in vivo. Numai atunci când glicerolul a fost adăugat ca plastifiant, s-ar putea obține filme de keratină relativ puternice și flexibile [35] . Fujii și colab. a demonstrat că keratinele de păr au fost utile pentru prepararea filmelor proteice și au descris o metodă rapidă de turnare [36] . Această cercetare a demonstrat, de asemenea, fezabilitatea de a încorpora molecule bioactive cum ar fi fosfatază alcalină în filmele de keratină pentru aplicații cu eliberare controlată. Filmele însă aveau o forță și o flexibilitate redusă [36] . Recent, s-au înregistrat progrese semnificative de către cercetătorii de la Universitatea Wake Forest, unde a fost prezentat keratinaextras din păr uman a fost folosit ca matrice pentru regenerarea nervilor periferici. Aceasta este în prezent una dintre cele mai avansate aplicații ale keratinei ca biomaterial [37]
Keratinele sunt nu numai complexe în ceea ce privește modelele de exprimare ale unei anumite specii de animale, ci și în ceea ce privește evoluția lor în cadrul Vertebrata; ele sunt markeri moleculari excelenți în ontogenie și patologie. Acest capitol discută keratinele de pește de la vale, rechin, păstrăv și zebră; urmărirea evoluției proteinei filamentului intermediar (IF) ar putea ajuta la rafinarea arborelui filogenetic al Vertebrata la anumite furcații adânci care până în prezent rezistă analizelor evolutive sau ar putea, de asemenea, să descopere indicii funcțiilor specifice ale subtipurilor individuale de proteine IF, care, la rândul lor, să înțeleagă rolul biologic al diversității lor în om. În complementară keratina legarea blot (CKBB) Teste, keratinssunt identificate în mod clar și pot fi imediat clasificate în polipeptide tip I și tip II. Imprimarea amprentă a peptidei ajută la gruparea polipeptidelor separate prin 2D-PAGE în clustere, fiecare reprezentând o autentică cheratină și modificările acesteia. În ceea ce privește secventierea cADN, amprentele de peptide de masă nu numai că furnizează identificarea proteinei secvențiate, dar confirmă, de asemenea, cu produsele de clivare teoretică că secvența de proteină derivată trebuie să fie corectă. Investigațiile biochimice și imunohistologice ale lămpiei, păstrăvului și rechinului prezentate în acest capitol au demonstrat că peștii exprimă sisteme complexe de keratine . Analiza secvențelor de keratinedin rechinul, rechinul, păstrăvul și zebra au dezvăluit în mod clar că identificarea omologilor de keratină în speciile îndepărtate evolutive nu este realizată prin simpla comparare a secvențelor noi cu cele deja existente în băncile de date, dar necesită o analiză filogenetică cuprinzătoare.
Fosforilarea cu keratină protejează împotriva degradării dependente de ubiquitină și reduce sensibilitatea la apoptoză
Fosforilarea cu keratină este un eveniment timpuriu în apoptoză ( Liao și colab., 1997 ). Acest lucru devine evident în celulele tratate cu anizomicina care induce apoptoza. Hyperphosphorylated K8-S73fost detectat în celulele A431 la 5 min de tratament anisomycin ( Woll et al., 2007 ) și hyperphosphorylated K8-S73, K8-S431 și K18-S52 au fost identificate în celulele HT29 după 30 min de plus anisomycin (Ku și colab., 1997 ). Interesant, hiperfosforilarea K8-S73 și K8-S431 a fost de asemenea observată ca răspuns la apoptoza indusă de Fas și TNF la șoareci ( Ku et al., 2003 ). Mai mult, fosforilarea K20-S13 a fost observată în timpul apoptozei ca urmare a colitei de șoarece indusă chimic (Ku și colab., 1997; Zhou și colab., 2006 ). Figura 5 prezintă un exemplu de apoptoză apoptoză spontană în keratinocitele umană HaCaT cultivate, care prezintă formarea granulelor unui reporter de keratină fluorescentă . Granulele de keratină nou formate devin pozitive pentru K5-T150 fosforilat.
Execuția apoptozei necesită scindarea mediată de caspază a mai multor proteine celulare. Keratins K14, K18 , K19 și K20 siturile țintă ale portului caspazei portuare (VEV / MDA / S) în domeniul tijelor lor. K18 conține secvența adițională de cracare a caspazei DALDS în domeniul cozii ( Ku și Omary, 2001, Ku și colab., 1997, Zhou și colab., 2006 ). Aceasta explică de ce activarea caspazei duce la o colapsare a rețelei de fier de keratină , care este urmată de formarea de incluziuni citoplasmatice mari. Sa observat în apoptoza indusă de TRAIL în linia celulară de celule MCF carcinom mamar că aceste incluziuni citoplasme conțin keratine hiperfosforilate (K18-S52) împreună cu keratina cracată cu caspazăfragmente și subunități de caspază catalitică ( MacFarlane și colab., 2000 ). Deși fosforilarea keratinelor aprecedat activarea caspazei și keratinele fosforilate colocalizate cu agregate apoptotice conținând caspază, fosforilarea keratinei nu și-a mărit propensitatea de a fi digerată de caspaze ( Schutte și colab., 2004 ). În acord, inducerea apoptozei în absența fosforilării K8-S73 prin tratamentul simultan cu inhibitorul de kinază dependentă de apoptoză roscovitină și staurosporina inhibitor de proteină kinază cu acțiune largă nu a împiedicat apariția incluziunilor apoptotice care conțin keratina cracată cu caspază fragmente (Schutte și colab., 2004 ). Totuși, fosforilarea keratinei poate mări dezintegrarea mediată de caspază a filamentelor de keratină în agregate.
Ubiquitinizarea, care este strâns legată de apoptoză, este influențată de fosforilarea keratinei . N – [ N – ( N – Acetil – l leucil) – l leucil] – l -norleucine (ALLN) Inhibarea proteazomală mediată în celulele HT29 a relevat prezența unor mici cantități de fosforilat K8-S73, K8-S431 și K18-S52 în fracțiunile de keratină ubiquitinate ( Ku și Omary, 2000 ). Raportul stoichiometric extrem de scăzut al K8-S73 / S431 fosforilat la K8 ubiquitinat total a indicat totuși că fosforilarea keratinei și ubicitinația sunt invers proporționate. Această noțiune a fost susținută de observația care a urmata fost crescută degradarea keratinei în celulele HT29 care produc mutanți K8-S73A fosfodeficient ( Ku și Omary, 2000 ). K8-S73 este conținut în motivul de secvență 69 QSLL S PL 75 care este conservat în keratine de tip II . Mutația K8-P74 la K8-L74, care împiedică fosforilarea lui K8-S73 de kinaza p38 orientată pe prolină, ubiquitinizare ridicată K8. Pe de altă parte, mutația K8-L71 la K8-P71, care creează un nou situs potențial de fosforilare la K8-S70, a condus la o scădere a ubiquitinării K8 ( Ku și Omary, 2000). Interesant este faptul că fosforilarea K8-S73 indusă de elementul P al proteinei antiapoptotice (PIWI) indusă de 2 prin intermediul p38MAPK și a condus la o scădere a degradării K8 mediate de ubiquitină ( Jiang și colab., 2014 ). Luate împreună, aceste observații au demonstrat că cheratină fosforilare protejează keratinsde degradare în timpul apoptozei. În plus, s-a propus ca menținerea nivelurilor de keratină să reducă sensibilitatea celulară la apoptoza indusă de Fas-mediată și TNF